類器官研究中生理氧氣的重要性

介紹

從事類器官、類器官融合體或球狀體研究的科學家，往往完全忽略了一個無形但重要的變數：氧氣。在標準的二氧化碳培養箱中，類器官培養於分壓（pO₂）大約為 130 - 160 mmHg（約 17 - 21% 氧氣）的大氣氧氣中，然而在人體內部，大多數組織所處的「生理」氧氣濃度要低很多，通常介於 8 至 85 mmHg（約 1 - 11% 氧氣）之間。這種情形可能會在體外實驗中造成氧化壓力以及非自然的細胞行為。

在細胞培養過程中控制氧氣以模擬體內狀態，已被證實能提高類器官的生理準確性、細胞存活率、分化、再現性以及轉化相關性。

這篇文章主要在類器官研究中使用生理氧氣（「生理低氧」），其範圍通常在 30 – 60 mmHg 氧氣分壓（約 4 - 8%）之間，同時也說明其局限性與細微差異。

在此過程中，將重點介紹用於氧氣控制與監測的專用工具如何讓這些操作在實驗檯上變得務實可行。

環境氧氣與類器官存活率：代謝壓力與壞死核心

在氧氣分壓約 160 mmHg（約 21% 氧氣）下培養類器官是標準做法，但對許多細胞類型而言，這是高氧狀態而非「正常」狀態。高氧狀態與活性氧化物質及氧化壓力的增加相關，這可能會損害生長與分化。以腎臟發育模型為例，160 mmHg 的氧氣分壓已被描述為非生理性，且對正常組織的形成有害。

隨著類器官的生長，它們的氧氣問題會變得更加複雜。在沒有血管系統的情況下，氧氣從表面擴散的距離非常有限。一旦類器官的直徑超過幾百微米，其中心區域的氧氣濃度可能會降至臨界值以下，進而陷入缺氧甚至無氧狀態。這些核心區域中的細胞往往會死亡，進而形成壞死中心，這會降低整體的存活率，並在類器官中造成異質性的細胞狀態。

將外部氧氣降低至更符合生理的標準，例如：約 40 mmHg（約 5%）的氧氣分壓，可以減輕部分的這種壓力。其目的並非要消除梯度，而是要讓外部與內部區域都更接近其體內的代謝基準點。在人類腸道類器官（結腸類器官）中，維持在約 15 mmHg（約 2%）氧氣分壓下培養的類器官，其生長出的活細胞品質明顯大於維持在約 154 mmHg（約 20%）氧氣分壓下的類器官。與高氧條件相比，生理低氧培養也傾向於對細胞激素刺激產生較低的促進發炎反應。

控制外部氧氣濃度並不能神奇地防止所有核心區域缺氧。在 40 mmHg 氧氣分壓下的一個非常巨大的類器官，其中心依然可能出現低氧狀態，這單純是因為在沒有血管系統或灌流的情況下，很難突破的擴散限制。在許多系統中，生理低氧所能做的是減少外層的慢性氧化壓力，並延緩或減輕核心區域壞死的嚴重程度。

氧氣在類器官發育與功能中的角色

氧氣不僅是一種燃料，也是一種關鍵的細胞訊號。體內的幹細胞微環境通常處於低氧狀態，大約在 8 至 38 mmHg（約 1 至 5%）的氧氣分壓之間。這些低氧張力有助於維持幹細胞特性、調節增殖，並透過缺氧誘導因子（HIFs）及其下游基因來控制分化。當類器官在類似的低氧範圍內培養時，這些相同的機制就能像在組織中一樣發揮作用。

生理低氧細胞培養通常會被採用，目的是隨著時間推移更好地維持幹細胞與前驅細胞群，支持類器官的持續生長，同時仍可以控制其沿著理想的狀況進行分化。在多個類器官系統中，較低的氧氣分壓已被證實與更真實的組織結構和標記表達有關。

在灌流式 3D 軟質微流體支架內生長的神經組織中，改善氧氣輸送能防止內核區域的細胞凋亡，並比無灌流、受擴散限制的對照組支援更廣泛的神經元與神經膠質細胞分支。在生理低氧下培養的腸道類器官會形成更接近體內狀態的隱窩 - 絨毛結構，且其上皮標記的表達模式也更緊密地類似於人類腸道組織。

一個吸引人的例子來自於腎臟類器官。當在約 54 mmHg（約 7%）氧氣分壓下培養以模擬胎兒腎臟的供氧狀態時，這些類器官與保存在 160 mmHg 氧氣分壓下的相同類器官相比，發育出更廣泛的微血管系統，包括更多的內皮細胞萌芽和更具互聯性的血管網絡。

低氧條件上調了促進血管生長因子並抑制了抗血管生長訊號，進而促進血管發育。

關鍵點在於許多類器官代表的是胎兒或早期的組織狀態，而在這些狀態下，較低的氧氣濃度才是常態。將細胞培養期間的氧氣條件與體內的條件配對，能讓細胞自身的發育更接近在體內運行的方式，而不是被推入高氧適應模式。

可重複性與實驗一致性

氧氣控制也是一個可重複性的問題。幾乎所有的培養箱和低氧箱目前仍是以百分比為單位來控制其氧氣環境。「5% 氧氣」的讀數可能會被解讀為在不同實驗之間具有等同的條件。然而在現實中，該 5% 是相對於環境壓力而言的，而環境壓力會隨著天氣、海拔或設施內的空調（HVAC）條件而改變。即使是百分之幾的大氣壓變化，也會影響細胞所經歷的氧氣分壓，而在僅顯示百分比的螢幕上不會有任何可見的提示。

當你以分壓的絕對單位進行操作時，40 mmHg 的氧氣就是 40 mmHg 的氧氣，無論是暴風雨天還是晴天，也無論實驗室是位於海平面還是科羅拉多州的丹佛。

因此，以分壓絕對單位來測量並控制氧氣的低氧系統，能夠提供更具可重複性的氣體環境。這對於類器官而言尤其重要，因為氧氣的微小變化就會改變增殖、分化與死亡之間的平衡，或是改變對藥物和訊號提示的敏感性。

穩定的生理低氧控制有助於減少因無意間的重新給氧或氧氣濃度漂移所帶來的變異性。如果類器官經常在正常氧和低氧環境之間移動，或者如果每當艙門打開時，氣體艙的氧氣需要超過 5 分鐘才能穩定，細胞就會承受動態壓力，而這在缺乏適當測量的情況下很難複製且幾乎無法量化。藉由控管良好的生理低氧工作站，這些變數會大幅減少，這可以將實驗結果歸因於您所設計的干擾措施，而不是氧氣的隱藏波動，變得更加容易。

在疾病模型建立與藥物研發中的轉譯相關性

許多疾病與氧氣緊密相關。實體腫瘤、缺血性心臟與腦組織、發炎的腸道以及纖維化的器官，皆涉及局部組織氧氣的改變。如果使用類器官來模擬這些狀況，卻是在環境氧氣的濃度中進行培養，那麼疾病環境中的一個重要部分就會缺失。

腫瘤生物學就是一個明顯的例子。患者體內的實體腫瘤通常涉及氧氣極低的區域，而這些低氧區與更強的侵襲性、代謝改變以及對治療的耐受性有關。一些在生理低氧（約 23 mmHg 或 3% 氧氣）條件下進行收集、處理和增殖的腫瘤細胞模型，與在環境氧氣下處理的相同細胞相比，在關鍵訊號網路以及對標靶療法的敏感性上，已顯示出明顯的差異。

這些研究結果顯示，使氧氣濃度與體內條件相配對，可以知道在偏高氧培養下可能會被忽略的生物學與治療相關行為。合理推測，相似的原則也適用於腫瘤來源的類器官以及其他 3D 腫瘤模型。

同樣的邏輯也適用於其他系統。例如，發炎性腸道疾病可能涉及腸道黏膜氧氣分佈狀況的改變。在先前提到的腸道結腸類器官研究中，維持在 15 mmHg 氧氣下的培養對促進發炎細胞激素的反應，與在約 154 mmHg 氧氣下的培養截然不同，且在生理低氧下傾向於產生較低的促進發炎反應。這表示氧氣張力不僅會影響生存能力和形態學，還會影響類器官整合免疫或發炎訊號的方式。

對於藥物研發或機制研究而言，這相當重要。在偏高氧類器官上測試時看起來很有前景的候選療法，在生存於 30-60 mmHg 氧氣下的組織中，其表現可能會截然不同。將生理氧氣納入類器官的工作流程中，能提高體外研究結果轉譯至動物模型並最終應用於患者的機會。

在生理低氧培養中的挑戰與考量因素

實施生理低氧培養並非完全隨插即用。這需要能夠降低氧氣並將其維持在特定目標值的設備，通常是透過將氮氣混入環境中來達成，且若能使用直接測量氧分壓（pO₂）而非從氣體百分比推算氧分壓的感測器，將會大有幫助。與傳統的二氧化碳培養箱相比，這增加了成本和一定的複雜性。

對腎臟具生理相關性的條件（大約 54 mmHg 氧氣）對結腸而言可能並不理想（結腸運作時可能更接近 15 - 40 mmHg 氧氣），依此類推。在一項研究中，在約 38 mmHg（≈ 5%）氧氣下生長的腸道類器官，在特定實驗方案下形成的隱窩結構較少，即便在不同的情境下 15 mmHg（≈ 2%）的氧氣具有明顯的好處。這些差異強調了有必要將 40 mmHg 的氧分壓視為一個合理的起點，而不是一個萬靈數字，且應根據每個模型的生物學特性進行調整。

最後，環境之間的過渡也需要注意。將類器官從生理低氧工作站直接移出至室內空氣中進行長時間的操作，可能會引發復氧壓力。理想情況下，操作應在受控的環境中進行，或至少保持短暫，以避免反覆刺激細胞。

HypoxyLab：真正模擬體內氧氣狀況

HypoxyLab™ 工作站的設計正是為了幫忙解決這些控制與再現性的問題。

HypoxyLab 是一款精簡型桌上型工作站，可為細胞培養創造一個完全受控的環境，其中包括對氧氣、二氧化碳、溫度和濕度的精確控制。

與僅以百分比調節氧氣的系統不同，HypoxyLab 是以分壓單位（mmHg 或 kPa）來測量並控制氧氣。

這讓使用者能夠明確設定氧分壓值，例如：設定為 40 mmHg 來模擬許多組織的典型生理低氧條件，或者在需要更極端的缺氧條件時設定為 15 mmHg 的氧分壓。

HypoxyLab 會自動補償氣壓的變化，因此 40 mmHg 的設定對於位於不同實驗室或在一年中不同時間點的細胞而言，其代表的意義完全相同。

對於類器官研究而言，這讓特定氧氣環境的再現性得以被明確定義：包括用於發育中組織的類胎兒期條件、用於癌症模型的類腫瘤範圍，或是用於基礎生長的健康生理低氧。

實用功能也同樣重要。HypoxyLab 具備污染控制功能且符合人體工學設計，並配有快速進出傳遞箱與清楚的內部工作空間。科學家可以進行更換培養基、繼代培養或成像，而無需將細胞反覆暴露於室內空氣中。對於類器官而言，這種穩定的生理低氧工作站可以成為其「大本營」，讓它們在受控且有紀錄的氧氣條件下生存、分化並對干擾措施做出反應。

OxyLite：即時測量培養基與類器官的氧氣狀況

設定目標氧氣氣體濃度是一回事；了解您的類器官實際經歷了什麼又是另一回事。這就是 OxyLite™ 氧氣監測儀特別派上用場的地方。OxyLite 是一款光纖感測系統，用於直接測量培養基或凝膠中的溶解氧。

在類器官的工作流程中，可以將 OxyLite 感測器放置於類器官附近的培養基中，或是嵌入類器官的基質中。科學家因此能夠驗證空間內的培養基是否已達到預期的氧氣濃度平衡，同時也能提供類器官隨時間消耗氧氣速度的動力學數據。

OxyLite 同樣以 mmHg 的絕對分壓單位來回報氧氣狀況，與 HypoxyLab 所採用的氧氣控制策略相同。

這些系統結合在一起，能將氧氣從一個被假設的背景條件，轉化為類器官培養中可被測量且最佳化的參數。

結論

類器官為人類生物學開啟了一扇全新窗口，但為了充分利用它們，我們不僅需要重建正確的細胞和基質，還需要重現正確的環境。氧氣是任何細胞環境的核心部分。大多數人類組織都在 8 至 85 mmHg 的氧氣範圍內運作，而非標準培養箱中常見的 160 mmHg 環境氧氣濃度。

當類器官在生理氧氣張力下生長時，它們通常會表現出更好的存活率、更接近真實的分化情況，以及更接近體內實驗所觀察到的刺激反應。

但也有需要注意的地方。生理低氧必須針對每種類器官系統進行調整，且其本身並不能解決所有的擴散或大小限制問題。然而，這確實讓模型朝著正確的方向發展，且藉由現代的控制與測量工具，在技術上已不再難以實現。

藉由將如 HypoxyLab 的生理低氧工作站與使用 OxyLite 的直接氧氣監測相結合，類器官研究人員能夠定義、提供並驗證其模型所經歷的氧氣分壓條件。這種從假設氧氣狀況到對其進行管理的轉變，是邁向更真實且具可重複性類器官科學的關鍵一步。

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6. Croft, J. (2022). Addressing the Reproducibility Issue within Hypoxia Chambers. Oxford Optronix Resources
7. Oxford Optronix HypoxyLab™ product information.
8. Oxford Optronix OxyLite™ product information.