Y maze Y字迷宮簡介

簡介

Y字迷宮是從歷史更悠久的T字迷宮所發展而來的。與岔路為直角的T字迷宮不同，Y字迷宮岔路的角度為更自然、幅度更緩的120度，對於要讓動物自然探索的實驗來說這是個很重要的特色。 探索實驗的結果受到動物認知與學習能力的影響，而這些能力牽涉到許多不同的腦區，例如海馬迴(hippocampus)、前腦基底部 (basal forebrain) 以及前額葉皮質(prefrontal cortex)。目前許多與神經退化性疾病的研究都指出海馬迴的損傷或病變會影響動物的認知與學習能力，進而造成病症。因此Y字迷宮可以反映出動物認知與學習能力的特色讓他在神經科學與行為研究等領域被廣泛利用。

Y字迷宮與T字迷宮一樣，只提供了動物兩個選擇 (當動物站在三臂中其中一個區域時) ，若您有在特定位置使用誘餌或獎勵進行Y字迷宮實驗，多次訓練後動物會毫不猶豫的直接前往那個有獎勵的正確區域。這種看似簡單的實驗內容卻足以驗證動物的認知與空間記憶的生成以及海馬迴的功能是否正常，若是被給予了某些藥物或是病變個體，這些學習或是記憶生成能力就會大幅下降。

Spence 與 Lippitt (1946) 在很多年前使用了簡易的Y字迷宮，最早的Y字迷宮如同T字迷宮，實驗設計包含了二選一的岔路，科學家們在一端放置飲水，另一端放置食物，動物進入了其中一端後閘門會關閉，動物會無法取得另一個獎賞，意即動物需要在這兩個獎賞擇一。到了1959年， Dember 與 Fowler 則是觀察出動物會自然的去探索尚未探索過的區域，因此提出了交替(alternation)的概念。就Y字迷宮來說，動物待在某個臂上時，一定會有一個臂是剛剛動物待過的，而另一個臂則是沒待過的(至少不是上個待過的臂)，這種按照順序探索，不會馬上折返回上一個待過的臂的行為即被稱做交替，交替行為需要空間記憶的生成才能有效發生，有空間記憶的支持動物才不會在兩個臂之間來回探索而忽視另一個臂。Y字迷宮由於其形狀更為對稱，從任何臂出發都是相同的景色與路線，比起T字迷宮又更適合觀察動物的交替行為。自此，Y字迷宮即成為了探索動物空間記憶生成的一個有效工具。

演變

Y字迷宮的一直被用來評估動物腦部各區域是否有介入空間記憶的生成，或是藥物/疾病是否會影響空間記憶。在 1986年， 就有學者結合了電生理與Y字迷宮，將動物特定腦區植入電極，且這些電極會在動物進入特定臂時進行刺激使之感到愉悅，多次訓練後動物會自主前往特定臂以獲得快感，且速度越來越快，這說明了動物可以藉由刺激驅使它與特定區域產生連結，且這個連結會隨著多次的刺激不斷的增強。

Conard 與他的研究團隊 則是利用加了線索的Y字迷宮進行慢性壓力與空間記憶/認知行為的相互關係的研究，動物需要在時限內多次進入正確的臂。實驗結果指出長期的心理壓力會顯著的影響雄性動物的空間記憶生成，使之亂無章法的進行探索，但有趣的是，雌性動物則是會猶如女力爆發般在測驗後期表現良好，這也許可以證明，性激素會影響壓力下的空間記憶生成，或是壓力下的空間記憶生成擁有性別差異。 同一個團隊(2005) 在之後的研究更指出了迷宮中有提示與否亦會影響壓力鼠的實驗結果，與正常動物相比，壓力鼠在有提示的迷宮中表現良好，但若是進到無提示的迷宮中，其探索的表現就會顯著的變差，有提示與否造成空間記憶生成的機制是不同的，因此這個研究結果可以說明壓力會影響至少一種空間記憶生成。

在2009年由 Hoeffer 與他的研究團隊 則是使用了水下Y字迷宮來進行FKBP12(FK506結合蛋白)缺陷鼠的學習記憶情形，這個改良過的水下Y迷宮結合了傳統的水迷宮的特色，在Y字迷宮的某一臂藏有逃生平台，在訓練期間要讓動物學習並記住逃生平台的位置，實驗階段時將平台移除，並觀察動物是否會在原本擁有逃生平台的臂試圖尋找平台，因而停留最長的時間。實驗結果則指出缺乏FKBP12的小鼠他在水下Y字迷宮的表現是比一般動物還差的，這說明了FKBP12會影響空間記憶的生成，讓動物在這種有訓練階段的實驗表現變差。

近期變化

Burguière與他的研究團隊在2010年則是利用水下Y字迷宮進行小腦皮質是否在條件學習佔有一席之地，他使用的是無法合成PKC的L7-PKCi基因轉殖鼠，這些轉殖鼠在訓練階段理應有能力順利發現且抵達逃生平台，但最後測得數據則指出這些動物是能知道平台位置的，但卻很難順利踏上平台，因此產生了訓練階段看似學習速度很慢但最後的實驗階段卻正常的狀況，顯然的動物是心有餘而力不足，但無法合成PKC並不會影響空間記憶的生成。

在2012年，Bai 與他的研究團隊則是使用Y字迷宮進行大鼠前中額葉皮質 (medial prefrontal cortex) 是否會影響空間記憶生成的相關研究，類似的研究包含了 Yang 與他的團隊 使用了包含兩種選擇的Y字迷宮來進行交替行為與空間記憶生成相關研究。

由於其在海馬迴學習記憶相關研究的成效卓越，Y字迷宮在空間記憶相關研究已被廣泛使用，尤其是藥物或毒素對於空間記憶生成的抑制。Liet 與他的研究團隊 用Y字迷宮進行退黑激素 (melatonin) 在大鼠注意力與學習記憶生成的相關的研究，退黑激素是會影響注意力與學習能力，但是短時間給予大量的激素是不會對注意力或學習能力有任何幫助的。

Yin 與他的研究團隊 則是將目標放在睡眠，他們想要探討睡眠剝奪是否會影響動物的學習記憶能力，在實驗的前期 (前7天)，睡眠被剝奪的小鼠仍然可以表現的如正常小鼠一般，然而在剝奪7天後，就有明顯的空間記憶被抑制的現象被發現，動物在無線索Y字迷宮的表現日漸下降。然而這個問題可以在剝奪睡眠前施予藥物hispidulin後有效避免。

硬體設備介紹

Y字迷宮的構造非常簡單，為三個尺寸相同的對稱走道以120度夾角排列所構成。走道的長度約為30-50公分，寬為10公分左右，迷宮擁有30公分高的牆壁以避免動物脫逃，若您今天是使用週齡較大的大鼠亦可考慮調整尺寸。迷宮視需求亦可架高使之離地至少50公分。接下來視您的實驗目的與設計，您可以在Y字迷宮添加更多的東西，例如在其中兩臂擺放獎勵或是逃生口，牆壁上亦可加入提示讓動物產生空間記憶，三臂入口處亦可裝設閘門將特定臂關閉 。迷宮顏色通常是不反光的黑色或其他深色，這樣能夠與動物造成足夠的對比亦不會讓動物感受到壓力，若是使用B6、C3H等深色系的動物，則建議使用淺藍或灰色等能夠製造對比的顏色作為背景顏色。

如同稍早提到的，Y字迷宮亦可與水迷宮結合，使之成為水下Y字迷宮，只要將獎賞改成逃生平台，且原本的迷宮可注水即可完成改裝。也因此Y字迷宮也可以拿來進行斑馬魚等水生動物的動物模式。

Y字迷宮通常會搭配軌跡追蹤軟體 (例如Noldus Ethovision XT) 來進行長時間的實驗以及分析，因此燈光影響是Y字迷宮實驗中很重要的一環，為了防止陰影影響影像品質，光源最好是能夠在迷宮中心的正上方。每一隻動物實驗完畢後都需要將迷宮使用酒精徹底清潔，以避免氣味殘留進而影響下一個實驗

實驗步驟

標準的Y字迷宮的實驗分組往往分為兩組：有使用藥物/治療的實驗組與無任何處置的對照組。需要觀察的項目也很簡單，主要就是動物會不會依序探索它剛剛沒探索過的臂，當實驗開始且動物抵達其中一個臂時，該動物接下來直接實驗結束都只會面臨2選1的抉擇，而當動物動身前往另一個臂時，自此它的兩個選擇永遠只有兩種結果：折返回上一個探索過的臂、或是尚未探索的臂，若動物的空間記憶有被建立，那它會記得上一個探索過的臂的位置，下一次的探索就不會前往該臂。標準的Y字迷宮有個顯而易見的優點，就是這個實驗迷宮本體完全沒有任何額外的壓力 (例如水迷宮有水、高架十字迷宮有危險區域等)，動物的探索行為全為自發性，因此探索的方式與順序全是動物自己的想法，幾乎不會有外力介入。

幾乎任何對海馬迴造成損傷的原因都會使得該動物探索Y字迷宮的表現變差，例如病變、物理性損傷、老化等。

Y字迷宮有非常多的實驗步驟可搭配，然而最常見的步驟為以下兩種：獎勵交替探索實驗 (Rewarded Alternation task) 以及自發交替探索實驗 (Spontaneous Alternation task) 。若要進行獎勵交替探索實驗，您需要指定各別的獎勵所在臂(不一定只有一個) ，若是自發交替探索則不需要準備獎勵或是誘因。目前已有證據指出自發交替探索更能夠鑑別動物海馬迴是否有損傷或病變，這些有問題的動物往往只會在兩個臂之間來回探索，而完全忽略第三個臂 (Deacon 與Rawlins 2006)。Y字迷宮的步驟繁多且可視需求進行調整，因此我們在此先以標準版本的自發交替探索實驗進行討論。

由於自發交替探索實驗需要依靠動物本身的好奇心驅使它進行探索，因此動物不需要事先適應，若動物提前適應並熟悉此環境，則有可能造成實驗階段動物懶得探索的情形。進行實驗時，我們需要將動物放在中間作為起始點，並記錄動物每次探索的臂為哪個，在經過數分鐘後(通常為2分鐘左右)，我們可得一長串的動物探索臂的順序排列，並在每一次試驗(trial)結束後將老鼠取出並清潔迷宮內部即可。每隻動物建議一天不要進行超過10個試驗，且最多進行12天的實驗(無論是否連續)。

數據分析

Y字迷宮能得到的數據很單純，基本上就是正確探索與錯誤探索的次數，例如我們將Y字迷宮的3臂命名為ABC，動物從中央起始點前往A，接著又到了B點，若是之後每次都探索新的臂而不是折返回舊臂，探索順序會變成ABCABCABC……只要動物探索的臂為正確的臂，我們就計數一次 (例如ABCAB，動物從C開始就都探索新臂3次且沒折返過，這樣我們計數為3) 。如果動物選擇折返，我們也給予一次錯誤記數 (例如ABA為一次錯誤) 。實驗結束時我們可以得到動物正確探索與錯誤探索的次數並照動物的組別去進行比較。計算探索次數時，您亦可將正確/錯誤的次數與總次數一起換算成百分比，以便觀察結果。照理來說，正常的動物可以維持著較高的正確探索率，然而有問題的動物 (病變、損傷或是服藥等) 之正確探索率會比較低。

長處與限制

Y字迷宮非常容易操作 (不管是對人還是對動物都是) ，且與其他認知行為相關的實驗比起來，其結果很容易再現。Y字迷宮不太會對動物產生壓力，因此也比較不會有數據不自然的爭議。此外，若真的要進行壓力相關的實驗， Y字迷宮也還是可以改裝成其他有壓力的樣式 (例如Y字水迷宮與高架Y字迷宮) ，這造就了許多種類的研究皆可使用Y字迷宮或是其變體。

雖然Y字迷宮簡單且成本低廉，但仍然有其限制：首先，撇開一開始的3選1，Y字迷宮的選項幾乎就是很簡單的2選1，這代表動物就算不用腦袋想也會有高達50%的機會猜對正確的臂，此外動物也有可能使用與空間記憶無關的線索進行實驗，例如聲音與氣味。

此外，Y字迷宮過於簡單的問題也會對動物造成影響，此迷宮要產生準確的結果需建立在動物的探索慾望之上，若迷宮環境過於簡單則動物很有可能會感到無聊，也很有可能經過數日的試驗後動物對迷宮內部瞭若指掌，在實驗期間直接睡給你看，即使是有獎勵驅使的獎勵交替探索實驗也可能出現這個問題 (Deacon & Rawlins 2006) 。Y字迷宮雖然可以加裝許多配件，但這些配件都會有機會對動物造成額外壓力，可能會讓動物對某個臂產生不好的印象。

最後，由於許多原因都會影響到Y字迷宮的結果，導致Y字迷宮不太適合作為一項研究的關鍵數據，Y字迷宮實驗模式成本低廉，很容易從頭建置，但在取得初步結果後還是建議搭配其他較複雜的實驗來佐證。

總結

• Y字迷宮是由T字迷宮發展而來，與夾角90度的T字迷宮相比，Y字迷宮的夾角為120度均分
• 較緩的岔路設計使得Y字迷宮更適合進行交替探索實驗
• Y字迷宮的結果取決於動物的自主探索
• Y字迷宮可塑性高，適合加裝其他的配件並修改實驗步驟
• Y字迷宮在進行海馬迴功能相關的認知功能的病理/藥理研究效果絕佳，且有許多文獻可供參考
• 有海馬迴相關疾病的動物在Y字迷宮的表現會顯著下降

參考文獻

Abreu MS, Giacomini AC, Rodriguez R, Kalueff AV, Barcellos LJ. (2017) Effects of ZnSO4-induced peripheral anosmia on zebrafish behavior and physiology. Behav Brain Res. 320:275-281. doi: 10.1016/j.bbr.2016.12.014.

Ainge JA, Tamosiunaite M, Woergoetter F, Dudchenko PA. (2007) Hippocampal CA1 place cells encode intended destination on a maze with multiple choice points. J Neurosci. 27(36):9769-79.

Amin SN, Hassan SS, Rashed LA. (2017) Effects of chronic aspartame consumption on MPTP-induced Parkinsonism in male and female mice. Arch Physiol Biochem. 1-8. doi: 10.1080/13813455.2017.1396348.

Aoki R, Tsuboi T, Okamoto H. (2015) Y-maze avoidance: an automated and rapid associative learning paradigm in zebrafish. Neurosci Res. 91:69-72. doi: 10.1016/j.neures.2014.10.012

Bai W, Liu T, Yi H, Li S, Tian X. (2012) Anticipatory activity in rat medial prefrontal cortex during a working memory task. Neurosci Bull.28(6):693-703. doi: 10.1007/s12264-012-1291-x..

BOTWINICK J, BRINLEY JF, ROBBIN JS. (1963) Learning and reversing a four-choice multiple Y-maze by rats of three ages. J Gerontol. 18:279-82.

Burguière E, Arabo A, Jarlier F, De Zeeuw CI, Rondi-Reig L. (2010) Role of the cerebellar cortex in conditioned goal-directed behavior. J Neurosci. 30(40):13265-71. doi: 10.1523/JNEUROSCI.2190-10.2010.

Cazala P. (1986) Self-stimulation behavior can be elicited from various ‘aversive’ brain structures. Behav Brain Res 22(2):163-71.

Conrad, C.D., Grote, K.A., Hobbs, R.J., Ferayorni, A. (2003) Sex differences in spatial and non-spatial Y-maze performance after chronic stress. Neruobio. Learning and Memory 79, 32-40

Cuevas-Olguin R, Roychowdhury S, Banerjee A, Garcia-Oscos F, Esquivel-Rendon E, Bringas ME, Kilgard MP, Flores G, Atzori M. (2017) Cerebrolysin prevents deficits in social behavior, repetitive conduct, and synaptic inhibition in a rat model of autism. J Neurosci Res. 95(12):2456-2468. doi: 10.1002/jnr.24072.

Deacon, R.M.J. (2013) Shallow water (paddling) variants of water maze tests in mice. J. Vis. Exp. 76, e2608

Deacon, R.M.J., Rawlins, N.P. (2006) T-Maze alternation in the rodent. Nature Protocols 1, 7-12

Dember, W.N., Fowler, H. (1959) Spontaneous alternation after free and forced trials. Can. J. Psychol. 13, 151-154

Fernandez-Martos CM, Atkinson RAK, Chuah MI, King AE, Vickers JC. (2016) Combination treatment with leptin and pioglitazone in a mouse model of Alzheimer’s disease. Alzheimers Dement (N Y). 3(1):92-106. doi:10.1016/j.trci.2016.11.002.

Fowler, H. Fowler, D.E., Dember, W.N. (1959) The influence of reward of alternation behavior. J. Comp. Physiol. Psychol. 52, 220-224

Fowler, H., Blond, J., Dember, W.N. (1959) Alternation behavior and learning: the influence of reinforcement magnitude, number, and contingency. J. Comp. Physiol. Psychol. 52, 609-614

Giralt A, Brito V, Chevy Q, Simonnet C, Otsu Y, Cifuentes-Díaz C, de Pins B, Coura R, Alberch J, Ginés S, Poncer JC, Girault JA. (2017) Pyk2 modulates hippocampal excitatory synapses and contributes to cognitive deficits in a Huntington’s disease model. Nat Commun. 8:15592. doi: 10.1038/ncomms15592.

HELLYER S, STRAUGHAN JH. (1961) Alternation as function of preliminary training and type of deprivation. Science. 133(3462):1422-3.

Hodges, H. (1996) Maze procedures: the radial-arm and water maze compared. Cog. Brain Research 3, 167-181

Hoeffer CA, Tang W, Wong H, Santillan A, Patterson RJ, Martinez LA, Tejada-Simon MV, Paylor R, Hamilton SL, Klann E. (2008) Removal of FKBP12 enhances mTOR-Raptor interactions, LTP, memory, and perseverative/repetitive behavior. Neuron. 60(5):832-45. doi: 10.1016/j.neuron.2008.09.037.

Huang L, Huang K, Ning H. (2017) Hispidulin prevents sevoflurane- Induced memory dysfunction in aged rats. Biomed Pharmacother. 97:412-422. doi: 10.1016/j.biopha.2017.10.142.

Jaworski CC, Andalo C, Raynaud C, Simon V, Thébaud C, Chave J. (2015) The Influence of Prior Learning Experience on Pollinator Choice: An Experiment Using Bumblebees on Two Wild Floral Types of Antirrhinum majus. PLoS One. 10(8):e0130225. doi: 10.1371/journal.pone.0130225.

Liet C, Amenouche F, Freret T, Boulouard M, Mauvieux B, Lelong-Boulouard V, Bocca ML. (2015) Effects of acute administration of melatonin on attentional, executive, and working memory processes in rats. Fundam Clin Pharmacol. 29(5):472-7. doi: 10.1111/fcp.12134. Epub 2015 Aug 11.

Llansola M, Montoliu C, Agusti A, Hernandez-Rabaza V, Cabrera-Pastor A, Gomez-Gimenez B, Malaguarnera M, Dadsetan S, Belghiti M, Garcia-Garcia R, Balzano T, Taoro L, Felipo V. (2015) Interplay between glutamatergic and GABAergic neurotransmission alterations in cognitive and motor impairment in minimal hepatic encephalopathy. Neurochem Int. 88:15-9. doi: 0.1016/j.neuint.2014.10.011.

Natt M, Lönnstedt OM, McCormick MI. (2017) Coral reef fish predator maintains olfactory acuity in degraded coral habitats. PLoS One. 12(6):e0179300. doi: 10.1371/journal.pone.0179300

Portbury SD, Hare DJ, Finkelstein DI, Adlard PA. (2017) Trehalose improves traumatic brain injury-induced cognitive impairment. PLoS One. 12(8):e0183683. doi: 10.1371/journal.pone.0183683.

Rostron CL, Gaeta V, Brace LR, Dommett EJ. (2017) Instrumental conditioning for food reinforcement in the spontaneously hypertensive rat model of attention deficit hyperactivity disorder. BMC Res Notes. 10(1):525. doi: 10.1186/s13104-017-2857-5.

Sevastre-Berghian AC, Făgărăsan V, Toma VA, Bâldea I, Olteanu D, Moldovan R, Decea N, Filip GA, Clichici SV. (2017) Curcumin Reverses the Diazepam-Induced Cognitive Impairment by Modulation of Oxidative Stress and ERK 1/2/NF-κB Pathway in Brain. Oxid Med Cell Longev. 2017:3037876. doi: 10.1155/2017/3037876.

Seyedhosseini Tamijani SM, Beirami E, Ahmadiani A, Dargahi L.(2017)  Effect of three different regimens of repeated methamphetamine on rats’ cognitive performance. Cogn Process.  doi: 10.1007/s10339-017-0839-0.

Sharma, S., Rakoczy, S., Brown-Borg, H. (2010) Assessment of spatial memory in mice. Life Sciences 87, 521-536

Simonnet MM, Berthelot-Grosjean M, Grosjean Y. (2014) Testing Drosophila olfaction with a Y-maze assay. J Vis Exp. (88). doi: 10.3791/51241

THORNDIKE, E. L. (1932) The fundamentals of learning. New York: Teachers College

TOLMAN, E. C. (1932) Purposive behavior in animals and men. New York: Appleton-Century

Tucker LB, Fu AH, McCabe JT. (2016) Performance of Male and Female C57BL/6J Mice on Motor and Cognitive Tasks Commonly Used in Pre-Clinical Traumatic Brain Injury Research. J Neurotrauma. 33(9):880-94. doi: 10.1089/neu.2015.3977.

Wahl D, Coogan SC, Solon-Biet SM, de Cabo R, Haran JB, Raubenheimer D, Cogger VC, Mattson MP, Simpson SJ, Le Couteur DG. (2017) Cognitive and behavioral evaluation of nutritional interventions in rodent models of brain aging and dementia. Clin Interv Aging. 12:1419-1428. doi: 10.2147/CIA.S145247.

Wang W, Yin J, Ma X, Zhao F, Siedlak SL, Wang Z, Torres S, Fujioka H, Xu Y, Perry G, Zhu X. (2017) Inhibition of mitochondrial fragmentation protects against Alzheimer’s disease in rodent model. Hum Mol Genet. 26(21):4118-4131. doi: 10.1093/hmg/ddx299.

Ward AJ, Herbert-Read JE, Sumpter DJ, Krause J. (2011) Fast and accurate decisions through collective vigilance in fish shoals. Proc Natl Acad Sci U S A;108(6):2312-5. doi: 10.1073/pnas.1007102108.

Wright, R.L., Conrad, C.D. (2005) Chronic stress leave novelty-seeking behavior intact while impairing spatial recognition memory in the Y-maze. Stress. 8, 151-154

Yang ST, Shi Y, Wang Q, Peng JY, Li BM. (2014) Neuronal representation of working memory in the medial prefrontal cortex of rats. Mol Brain. 7:61. doi: 10.1186/s13041-014-0061-2.

Yin M, Chen Y, Zheng H, Pu T, Marshall C, Wu T, Xiao M. (2017) Assessment of mouse cognitive and anxiety-like behaviors and hippocampal inflammation following a repeated and intermittent paradoxical sleep deprivation procedure. Behav Brain Res. 321:69-78. doi: 10.1016/j.bbr.2016.12.034.

Zhao B, Ren B, Guo R, Zhang W, Ma S, Yao Y, Yuan T, Liu Z, Liu X. (2017) Supplementation of lycopene attenuates oxidative stress induced neuroinflammation and cognitive impairment via Nrf2/NF-κB transcriptional pathway. Food Chem Toxicol. 109(Pt 1):505-516. doi: 10.1016/j.fct.2017.09.050.

Zou W, Yuan J, Tang ZJ, Wei HJ, Zhu WW, Zhang P, Gu HF, Wang CY, Tang XQ. (2017) Hydrogen sulfide ameliorates cognitive dysfunction in streptozotocin-induced diabetic rats: involving suppression in hippocampal endoplasmic reticulum stress. Oncotarget. 8(38):64203-64216. doi: 10.18632/oncotarget.19448.