斑馬魚的基礎行為神經科學

為什麼我們要研究斑馬魚的行為？

斑馬魚近年來在行為神經科學和生態毒物學逐漸受到歡迎。牠們的吸引力在於生長迅速、透明度和與人類的基因有驚人的相似性。再者，作為一種脊椎動物且具有良好特徵的基因組，斑馬魚具有讓我們探索基因和行為背後基礎的神經機制之價值。藉著研究斑馬魚的各個發展階段，我們可以得到人類健康和疾病的寶貴資料。這個章節會向各位解釋為何和如何研究斑馬魚可以豐富我們的知識庫，以及它作為生物模型的未來所在。

 

 

與人類的遺傳和神經的相似性

斑馬魚用於行為研究的關鍵原因之一在於它們與人類共有的遺傳和神經相似性。人類基因大約有70%的都可以在斑馬魚上找到對應的基因組，我們還是對大部分基因的功能尚未釐清。這種遺傳相似性為研究人員提供了研究特定基因對各種行為表現的影響之契機，進而與人類狀況建立關聯性。此外，斑馬魚神經系統的基本組織和功能與其他脊椎動物，包括人類相似。這種結構和功能的保守性使科學家能夠深入研究神經迴路、神經傳導物質系統和型塑行為的分子途徑之基本面。因此，斑馬魚成為了發掘這些行為的複雜動態與其神經與基因機制。

 

成長快速和高繁殖率

斑馬魚以牠們的生長速度和高繁殖率聞名，這讓牠們高度適合做為行為研究的受試。牠們的神經系統在成為受精卵後在幾天之內就已經發展完成。

此外，斑馬魚每週能夠產數百個卵，是大規模行為研究的理想模型生物。快速發育和高繁殖力的組合使研究人員能夠快速獲得大量樣本，增強對微小行為差異的檢測並提高實驗的統計力。

斑馬魚是體外受精的，並且可以在大型實驗室中輕鬆管理，這有助於它們在高通量篩選和大規模遺傳研究中應用。這些特徵使研究人員能夠進行徹底的行為分析，並快速識別與各種行為特徵相關的遺傳因素。

 

藥物發現與篩選

上述的特質讓研究者讓斑馬魚的胚胎和幼魚在不同的化合物中暴露並觀察在相對短的時間內評估牠們的行為、神經發展與功能之影響。

常見的依變項是物理變化、行為改變或分子反應。

這些研究不限於任何特定的疾病種類。從神經系統疾病到心血管疾病和癌症，斑馬魚的使用可以協助多種人類疾病的藥物開發的早期階段。這種方法比傳統方法或使用囓齒動物更有效且更具成本效益。

透過遺傳學研究，例如使用morpholino oligonucleotides（可以阻斷基因功能的小分子），研究人員可以系統地研究單一基因在疾病中的作用。這使它們成為尋找和驗證新藥物標靶很有利的工具。或者，斑馬魚的這些類似疾病的狀況可以作為更多研究的基礎，以尋找可以改善這種病況的基因或藥物。

 

透明的胚胎和幼魚

斑馬魚胚胎和幼魚的透明度為研究人員提供了了解其神經系統即時發育和功能的獨特窗口。透過先進的成像技術，如共焦顯微鏡或雙光子成像，科學家可以視覺化單一神經元的活動，並追蹤它們對整個發育過程中行為的影響。

高透明度對於觀察自然神經發育來說不只是一種恩惠，它也提供了研究者利於監控操弄基因與藥物治療的效果。

這使他們能夠親眼目睹這些變化如何改變神經功能和發育，以及這些變化如何反過來影響行為。透過直接觀察這些過程，斑馬魚胚胎和幼魚的透明度有助於更全面地理解遺傳學、藥物作用、神經發育和行為之間的複雜的相互作用。

 

高產出與低成本

斑馬魚由於體型相對較小且能夠大量飼養，為行為研究提供了一種更便宜的選擇。斑馬魚可以生產非常多卵，這些卵的發育時間很短：最早在受精後 6 小時內開始原腸胚形成，並在 2 天後孵化，產生自由遊動的幼魚。

因此，可以在短時間內獲得大量的幼魚或成年動物，然而，由於胚胎或成體尺寸較小，因此僅需要很少的空間來容納這些大量的斑馬魚。因此，相較於較大的動物模型，例如大小鼠，斑馬魚的飼養成本相對低很多。

道德層面的考量和3R

3 R（replacement替換、reduction減少、refinement精緻化）形成了一個框架，促進在研究中人道和負責任地使用動物。遵守 3R 原則使科學家能夠減輕對動物福利的影響，同時提高研究的品質、可靠性和可重複性。

  

Replacement替換

Replacement的重點是使用替代方法，指在研究中使用動物的替代方法。由於斑馬魚與人類具有顯著的遺傳和神經相似性，因此研究人員可以在某些行為和遺傳研究中取代囓齒動物等哺乳動物。此外，斑馬魚透明的胚胎和幼魚有利於非侵入性成像，減少了侵入性手術的需要，並在一些研究環境中取代了不太合適的動物模型。

Reduction減少

減少的目的是最大限度減少實驗中使用的動物數量，同時仍提供可靠和有效的科學結果。鑑於斑馬魚的高繁殖力和快速發育，斑馬魚能夠在短時間內對大量個體進行研究，並以更少的動物獲得具有統計意義的數據。

此外，先進的實驗設計和數據分析技術可以幫助研究人員減少研究所需的斑馬魚數量，並最大限度地從每個個體中獲取資訊。

Refinement精緻化

精緻化涉及修改實驗程序和畜牧業的實踐，以盡量減少動物的疼痛、痛苦和痛苦。在斑馬魚的研究中，其中包含了優化飼養條件、處理方法和實驗程序減少壓力並維護動物福祉。測量斑馬魚行為過程中，研究者需要打造比擬自然生態的飼養環境，盡可能減少斑馬魚的壓力和不適感，採用非侵入性或微創技術，並在需要時採用適當的麻醉和疼痛。

 

什麼時候要測量斑馬魚的行為？

斑馬魚的身體大小和行為會隨著年齡增加有顯著的改變，並基於測量的方法與想觀察的依變項，與研究問題的需要，選擇適當的年齡/階段進行研究非常重要。這個章節中，我們會解釋斑馬魚的不同成長階段與相關的行為，透過了解每個特定階段要測量的內容（以及您能測量的內容），從而促進實驗計劃並確保獲得有用的結果。

 

胚胎階段 (embryobic stage) 0-3 hpf

胚胎時期 (受精後0-3天, days post fertilization, dpf) 的斑馬魚成長速度很快，在受精後的幾天之內，胚胎有許多關鍵發展可以觀察。在這個階段，魚體是透明的且幾乎沒有活動能力。從胚胎期到孵化期在攝氏28.5度的環境下需要48-72小時 (hours post-fertilization, hpf)。在這段期間，斑馬魚的胚胎會出現自發性的肌肉收縮，最初是對觸摸的反應，後來是以協調的方式進行。

研究者可以研究發展期中的基本動作和感官功能，以及涉及的神經迴路。

主要量測的行為：

• 自發性的動作- 在發展階段早期，斑馬魚會出現自發性的肌肉收縮，可針對其作為神經肌肉系統的功能相關之研究。早在17 hpf時就可以觀察到自發性運動和捲曲的存在和頻率。觸摸促發反應- 藉由輕輕的觸摸胚胎，研究者可以評估他們的感官與動作系統。
• 觸摸促發反應-是測量胚胎的重要測量工具。約27hpf這個反應即可以被觀察到，此時胚胎表現出對觸覺刺激的運動反應，通常涉及快速、急促的運動或盤繞。這可以讓研究者研究活動功能、發展階段以及涉及感官輸入的神經迴路反應。
• 光運動反應- 胚胎對於光刺激而表現出運動變化。

 

幼魚階段 (larval stage)

隨著斑馬魚進入幼魚階段，它們的解剖結構變得更加複雜，行為範圍也擴大。幼魚階段從孵化後開始，持續到大約30 dpf。在此期間，斑馬魚表現出各種可以隨著它們不斷發育和成熟而測量的行為。研究人員可以研究運動、躲避掠食者、社交互動以及環境刺激對行為的影響。

早期幼魚階段 (early-larval stage) 3-7dpf

主要量測的行為：

• 自由游泳- 幼魚開始自由游泳。這種行為可以用來研究它們的運動功能。
• 進食行為- 隨著消化系統的發育，它們開始以微生物為食。這提供了研究進食行為的機會。
• 視覺反應- 眼睛的成熟使他們能夠對視覺提示做出反應。研究人員可以研究趨光性等行為，即幼魚趨向或遠離光線的行為。

 

中期幼魚階段 (mid-larval stage) 7-14 dpf

主要量測的行為：

• 改善運動能力- 鰭的發育可以實現更進步的游泳模式，可以使用各種行為分析進行評估。
• 躲避掠食者- 它們的感覺系統，特別是視覺和側線的成熟，使幼魚能夠更好的應對潛在的威脅。研究員可以研究捕食者與獵物之間互動和防禦行為。
• 社交行為- 大約在這個時候，幼魚開始表現出組隊游泳 (shoaling)的早期跡象，這是一種成群游泳的社會行為。這可用於研究社交互動和所涉及的神經迴路。

 

晚期幼魚階段 (late-larval stage) 14-30 dpf

 

主要量測的行為：

• 複雜的運動- 幼魚可以表現出更複雜的游泳模式，與成魚相似。研究這些模式可以深入了解運動功能和神經肌肉協調性。
• 進階的社會互動－隨著幼魚的成長，它們的群聚行為變得更加明顯。研究這些群體行為可以提供對社會認知和行為的見解。
• 學習與記憶- 研究人員可以在這個階段開始研究學習和記憶，因為可以訓練幼魚將特定刺激與獎勵或懲罰產生連結。例如，Widder等人的研究顯示了斑馬魚幼魚學習和記住環境條件與社會獎勵之間關聯的能力。斑馬魚幼魚 (6-8 dpf)會經過聯結學習的訓練，將不利的空間位置（房間的黑暗位置）與社會獎勵聯繫起來。

 

青少年與成魚階段 (Juvenile & Adult stage)

隨著斑馬魚從幼魚階段過渡到幼年和成年階段，我們看到了更進一步的發育和成熟。這個時期從大約 30 dpf 開始，一直延伸到魚的一生超過 90 dpf，帶來顯著的身體、生理和行為變化。青少年階段和成年階段之間的區別通常以性成熟為標誌，性成熟發生在 90 dpf 左右，儘管這可能會因飲食和環境條件等因素而有所不同。

在這些階段中，最終斑馬魚的體型終於定型，色素沉澱停止發育，兩性特徵變得明顯。他們的行為也日趨成熟，也有更複雜的動作模組產生。這些成長階段供研究者研究一系列的行為，從複雜的社交行為到生殖行為和長期記憶。

透過研究這些發展階段，斑馬魚在科學領域成了更強大的動物模型，並非只有在基因遺傳和發展上有貢獻，更提供了人類對複雜行為與疾病上進一步的研究價值。

 

青少年階段 (Juvenile stage) 30-90 dpf

主要量測的行為：

• 複雜的運動能力 (locomotion)- 已經發育完全的鰭讓青少年階段的斑馬魚可以執行複雜的游泳模式，使研究者可以得到更多關於斑馬魚的運動功能和神經肌肉協調的資訊。
• 社交互動- 到了青少年階段，斑馬魚的社交行為日趨複雜。研究人員可以觀察和測量成群和求偶行為，這兩者都為社會認知和行為貢獻了珍貴的研究資料。
• 學習和記憶- 學習和記憶能力發展的更成熟。透過訓練，研究人員可以深入研究這些認知功能。

 

成年階段 (adult stage) 90+dpf

主要量測的行為：

• 交配行為- 成年斑馬魚表現出一系列性和生殖行為，包括求偶儀式、交配和照顧子代。可以研究這些行為以了解繁殖策略以及各種因素對繁殖成功的影響。
• 社會階層- 成年斑馬魚會建立起社會階層制度，斑馬魚學習和記憶的能力已經完全發展成熟。這使得研究人員能透過各種訓練典範來深入研究認知功能。
• 壓力和焦慮- 成年斑馬魚經常作為研究壓力、焦慮與相關行為的研究對象。

重要的一點是，這些行為發展的時間可能會根據水溫而產生變化，在溫暖的水中發展得更快。上述的行為發展的年齡是約在一般實驗室溫度為28.5°C下所飼養的斑馬魚。

 

 

如何測量斑馬魚的行為？

您可以使用一些很好用的工具來測量斑馬魚的行為。根據斑馬魚的發育階段，這些工具的使用時機可能會不一樣。

DanioScope（適用於研究胚胎和幼魚之形態學）、DanioVision（適用於研究幼魚行為）和 EthoVision XT（適用於研究幼魚和成魚行為）等強大工具能準確測量每個階段生理和行為參數。本章說明如何正確使用這些工具、它們在哪些研究領域中使用，以及斑馬魚的一些常見行為程序（以及它們的結果代表什麼意義！）。

 

Danioscope- 自動偵測斑馬魚胚胎

在斑馬魚的早期發育過程中，身體的透明度和自發性運動和觸摸促發反應等行為非常突出。DanioScope是研究員用來測量這些行為和生理的專用工具。此軟體解決方案與影像顯微鏡（例如 ZEISS SteREO Discovery.V8）結合使用，可取得由 DanioScope分析的詳細影像和影片檔案。

使用 DanioScope 的研究經常檢查斑馬魚胚胎模型，並專注於形態特徵和一些指標，例如身體長度、卵黃大小和心率。這些指標在發育生物學、神經學、毒理學和心臟病學中非常重要，提供對發育、突變或藥物影響的研究資料。

 

Daniovision- 完整且受控制的觀察室

DanioVision 是一個完整的觀察系統，專門設計為斑馬魚幼魚和其他小型生物的高通量追蹤而設計。在幼魚中，DanioVision 用於分析運動和社會行為。系統設有斑馬魚行為觀察室，為實驗提供受控環境。觀察室配有高品質攝影機，系統會附上預先安裝在電腦上的專用軟體 EthoVision XT。EthoVision XT 可以追蹤和分析個體或群體斑馬魚的行為，例如游泳速度和位置偏好。

DanioVision 經常用於與藥物開發、行為遺傳學、毒理學和晝夜節律相關的研究。在這些研究中，幼魚活動和運動模式是基本測量，可以揭示刻板行為和癲癇行為、晝夜節律、運動控制、運動障礙、神經發育等資訊。

 

Ethovision XT- 強大的影像追蹤系統

EthoVision XT 是世上最常用的影像追蹤系統，也是一個讓您可以您建立自己設定的軟體平台。影像追蹤本質上代表 EthoVision XT能從即時影像來源或影像檔案中識別您的斑馬魚（成魚或幼魚），並能夠追蹤其運動、活動、速度、旋轉等。

作為“DanioVision 的引擎”，您可以使用 EthoVision XT 來設定 DanioVision 觀察室中白光的強度，這可以讓您誘發驚嚇反射或模擬晝夜週期。您還可以控制光刺激的頻率、時間和持續時間。所有操作都記錄在軟體中，這有助於近乎自動化的分析。 DanioVision 系統的附加元件，例如tapping device或光遺傳學設備，也可以使用 EthoVision XT 進行程式設計與控制。

DanioVision 系統隨附的 EthoVision XT 軟體不僅限於 DanioVision 系統，還可用於其他實驗。例如，您可以在做成魚的魚群測試、T 迷宮學習、穿梭箱測試、位置偏好等。

 

Track3D- 三維的立體影像追蹤系統

雖然 EthoVision XT 擅長二維跟踪，但斑馬魚在3D空間中的行為（例如潛水或貼著牆）需要額外的工具。Track3D 透過提供3D追蹤功能來補足EthoVision XT，使研究員可對斑馬魚進行基於深度的行為分析，對綜合行為研究提供無價的價值。

例如，在新的水箱測試(novel tank test) 中，魚可能會表現出趨觸性（貼著牆壁遊動）或潛水的行為。三個維度的追蹤對於區分這兩種行為非常有用。同樣，雖然在 2D 中進行的速度和移動距離測量通常會給出很好的近似值，但有時可能會遺失訊息，原因很簡單，因為魚直直地游向相機，而沒有記錄任何活動。

 

斑馬魚適用於以下研究領域

• 心臟病學和血管研究
• 形態學研究
• 腫瘤學
• 神經科學與行為
• 生態神經毒理學

 

我們如何測量斑馬魚的行為？

胚胎和幼魚的實驗程序

以下實驗程序可作為您在斑馬魚行為研究踏出第一步時的基本準則。雖然這些建議目的是在幫助您實驗開始的步驟，但有必要根據具體的研究目標和實驗狀況進行調整。

 

斑馬魚胚胎期的光運動反應 (photomotor response, PMR)

這是一項重要的行為評估，可以深入了解斑馬魚發育與生理學的多方面向，例如神經發育，還有視覺系統的功能。這個測驗可以用來作為藥物或毒劑對神經系統影響之評估。化合物影響神經功能進而可能使PMR產生變化。最常被研究的發展階段是22-28 hpf之間。在這個階段，斑馬魚的胚胎已經發展出適應光學運動反應的基礎神經迴路，但是他們還無法自由的游泳。

 

斑馬魚幼魚的觸摸誘發反應 (touch-evoked response)

觸摸誘發反應是一種基本反射，表示功能正常和感覺神經元、中間神經元和運動神經元的連結。這個測驗同時也可以探究神經系統的發展和功能，特別是機械感覺神經元(mechanosensory

Neurons)。在反應當中出現的異常顯示出在這些感覺細胞發展異常的狀況。早在2 dpf 時就可以在斑馬魚幼魚中觀察到觸摸誘發反應。在這在這個階段，幼魚已經充分發育，能夠對觸覺刺激表現出清晰的運動反應。這些反應會隨著幼魚的發育變得更有力。一般來說，研究者可以在2-5 dpf時期觀測到觸摸誘發反應，根據實際情況而定研究目標以及他們有興趣觀察的發展階段。

 

斑馬魚幼魚的驚嚇反應 (startle response)

斑馬魚幼魚的驚嚇反應主要評估聽覺和前庭系統(vestibular systems) 的功能。明顯的驚嚇反應顯示內耳結構負責用於偵測聲音和位置變化的功能是正常的。此反應中出現的任何異常均可能顯示神經發育或連接方面的缺陷。從5dpf以後可以從幼魚身上觀察出驚嚇反應。到了這個階段，內耳結構和相關的神經迴路已經發展到足以檢測和處理聽覺或振動刺激。會隨著幼魚的繼續發育，反應變得更強烈和一致。

 

斑馬魚的趨觸性 (thigmotaxis)

趨觸性，或偏好靠近牆壁或邊緣移動，被認為是動物（包括斑馬魚）出現類似焦慮的行為表現。

花更多時間的幼魚在競技場邊緣而不是中心的區域表現出趨觸行為，這可以是被解釋為焦慮或壓力過大的跡象。在趨觸性中觀察到的行為可能涉及焦慮和壓力的神經迴路和神經傳導物質系統的改變。

可以在6 dpf的斑馬魚幼魚中觀察到趨觸性。到這個階段，幼魚已經充分發育能夠表現出明顯的行為偏好。該行為實驗通常在 6 ~ 9 dpf 之間進行，但也可以從幼魚早期擴展到幼魚晚期，取決於研究的目標。其中必須確保實驗場域大小與受試斑馬魚的年齡和大小。

 

青少年魚和成年魚的實驗程序

以下實驗程序可作為您在斑馬魚行為研究踏出第一步時的基本準則。雖然這些建議目的是在幫助您實驗開始的步驟，但有必要根據具體的研究目標和實驗狀況進行調整。

 

斑馬魚的開放空間測驗 (Open Field Test, OFT)

開放空間測驗 (Open Field Test, OFT) 有助於評估斑馬魚的一般運動活動和探索偏好。活動的總距離、速度和軌跡可提供魚的活動量和探索新環境的意願等訊息。

魚在水箱中心的時間與水箱周圍的時間對比可以了解是否出現類似焦慮的行為。對周圍的偏好表示焦慮越高，而在中心待的時間越多表示焦慮程度越低。開放空間實驗通常在成年斑馬魚上進行，通常年齡超過受精後 3 週。在這個階段，斑馬魚已經達到一定的發育水平，可以觀察活動、焦慮行為和探索傾向。然而，受試確切的年齡可能會依據研究的目標和實驗設計而有所不同。測試還可以適用於青少年斑馬魚或晚期幼魚，並持續觀察水箱尺寸和實驗的持續時間以適應魚的發育階段。

 

新奇水箱潛水測試 (novel tank diving test)

新奇水箱潛水測試是一種備受廣泛認同的行為測驗法，用於評估斑馬魚的焦慮行為。表現出類似焦慮行為的魚會在魚缸底部停留更多時間，表示壓力或恐懼越大。該實驗也提供了探究神經生物學涉及焦慮和壓力反應的生理機制的契機。

新奇水箱潛水測試通常在成年斑馬魚上進行，通常是受精後 3 週以上，此時它們已發育成熟並表現出明顯的行為反應。然而，根據研究目的，該測試也適用於青少年斑馬魚。

 

T-maze測試

T 迷宮測驗是評估斑馬魚認知功能和做決策的重要行為實驗。它能評估斑馬魚對於做決定的能力與探究他們的行為表現。藉由重複試驗和改變測試條件，研究員可以評估斑馬魚的短期與長期記憶。選擇保持一致性或選擇改變經過反覆測試可以顯示記憶的留存或缺陷。T 迷宮實驗通常是用成年斑馬魚為受試進行，通常是受精後 3 週以上，此時它們已達到發育成熟度可以對認知功能、記憶與決策進行全面評估。

 

社交互動實驗  (social interaction test)

社交互動實驗對於評估斑馬魚的社交行為和偏好相當重要。

它評估斑馬魚與同類互動的傾向，深入了解它們的行為社交親近力或社交迴避。此實驗可以探究社會行為的神經生物學基礎，有助於了解特定腦區、神經傳導物質和神經迴路在調節社會互動和偏好時

的角色。